Los gemelos Mysliveček también tenían una hermana, Maria Anna, que ingresó en un convento en la edad adulta. Jáchym se ganó la vida como molinero en Praga hasta su muerte.  Josef aparentemente asistió a una escuela dominicana en la Iglesia de St. Giles, donde probablemente también fue a clases de música. Posteriormente, parece que se cambió al  colegio jesuita en Klementinum, donde se puso gran énfasis en la preparación musical de sus alumnos. Sabemos que se matriculó en la Universidad Charles-Ferdinand pero se fue después del primer año porque ‘no hizo ningún progreso en lógica’. Posteriormente aprendió el oficio de molinero, estudiando hidráulica y materias matemáticas, entre otras, como se exigía a los molineros de la época. Completó con éxito sus estudios, fue admitido en el Gremio de Praga como maestro molinero y comenzó a trabajar en los molinos familiares. 

Josef aparentemente asistió a una escuela dominicana en la Iglesia de St. Giles, donde probablemente también fue a clases de música. Posteriormente, parece que se cambió al  colegio jesuita en Klementinum, donde se puso gran énfasis en la preparación musical de sus alumnos. Sabemos que se matriculó en la Universidad Charles-Ferdinand pero se fue después del primer año porque ‘no hizo ningún progreso en lógica’. Posteriormente aprendió el oficio de molinero, estudiando hidráulica y materias matemáticas, entre otras, como se exigía a los molineros de la época. Completó con éxito sus estudios en 1761, fue admitido en el Gremio de Praga como maestro molinero y comenzó a trabajar en los molinos familiares.  Mysliveček no se centró en la música hasta los veinticinco años, momento en el que repentinamente decidió cambiar de rumbo en la vida y convertirse en compositor y virtuoso del violín. Es posible que en su decisión haya influido el hecho de que en aquella época se volvían a representar óperas italianas en Praga tras una ausencia forzosa provocada por la Guerra de los Siete Años. Estas producciones probablemente llamaron tanto su atención que decidió dejar su huella en el género él mismo.

Casa de la familia Mysliveček en la calle Melantrichova, Praga

Primero, a principios de la década de 1760, completó su  educación musical en Praga con František Václav Habermann y Josef Seger y comenzó a escribir sus propias composiciones sorprendentemente rápido: su obra más antigua que se conserva es la exitosa  Sinfonía en do mayor.. Sin embargo, la educación italiana era indispensable para los compositores de ópera de la época y Mysliveček, al igual que otros importantes músicos de las tierras checas, como Christoph Willibald Gluck, que pasó su infancia y juventud en Chřibská cerca de Děčín y en la casa solariega de Jezeří, y nativo de la ciudad de Most Leopold Gassmann, partió hacia Italia. Mysliveček  partió hacia Italia en el otoño de 1763 con el apoyo del destacado mecenas de las artes el Conde Vincenz von Waldstein. Fue a Venecia para estudiar con Giovanni Pescetti, probablemente porque las óperas italianas que se representaban en Praga y los vocalistas que cantaban en ellas eran a menudo de procedencia veneciana. En 1766, aproximadamente dos años y medio después de su llegada a Venecia, su primera ópera “Semiramide” se representó en Bérgamo y obtuvo un éxito considerable, lo que le brindó a Mysliveček más oportunidades, incluida una invitación para componer una ópera para Nápoles.

Durante su estadía en Italia, Mysliveček viajó de ciudad en ciudad, compuso para varios teatros y nunca aceptó un puesto permanente. Estuvo asociado principalmente con el Teatro San Carlo napolitano, que era el escenario europeo más prestigioso de su tiempo en términos de ópera seria italiana. Fue en este estimado teatro donde se representaron más óperas de Mysliveček que en cualquier otro lugar.  La primera ópera de Mysliveček para Nápoles,  “Il Bellerofonte”, tuvo una acogida entusiasta. Los papeles principales fueron interpretados por el tenor Anton Raaff y la soprano Caterina Gabrielli., dos de las estrellas de ópera más famosas de la época, y Mysliveček trabajó con ellos muchas veces en el futuro. Otros colaboradores favoritos incluyeron a Luigi Marchesi, uno de los sopranos masculinos (castrati) más admirados de la época. La respuesta positiva a la ópera dio lugar a encargos para muchos otros teatros italianos, incluidos  Florencia, Roma, Venecia, Turín y Bolonia. En Italia se hizo conocido como Il Boemo ("el bohemio") y también Venatorino ("el pequeño cazador"), una traducción literal de su nombre. Los informes de que fue conocido como Il divino Boemo ("el divino bohemio") durante su vida son falsos. El apodo se originó a partir del título de un romanetto sobre el compositor de Jakub Arbes que se publicó por primera vez en 1884.

Retrato póstumo de Josef Mysliveček por Jan Vilimek por

En 1770, Mysliveček conoció al joven de 13 años Wolfgang Amadeus Mozart y a su padre Leopoldo en Bolonia. Ese año, Wolfgang Mozart trabajaba en la ópera “Mitridate, re di Ponto”, que se iba a representar en Milán. Se le menciona en veintiocho de las cartas sobrevivientes de la correspondencia de la familia Mozart entre 1770 y 1778, aunque incluso esta cantidad significativa de correspondencia es probablemente solo una fracción. Fue nombrado miembro de la Accademia Filarmonica di Bologna .en 1771. Mysliveček apreciaba la libertad de movimiento y nunca fue empleado directamente por ningún noble, prelado o gobernante, a diferencia de la mayoría de sus contemporáneos. Se ganaba la vida enseñando, interpretando y componiendo música, y con frecuencia recibía propinas de admiradores adinerados. Mysliveček también logró un gran éxito en Múnich , donde se representó su ópera  “Ezio”  en 1777, al igual que su oratorio  “Isacco, figura del redentore”, del que Wolfgang Mozart sugirió en una carta que ‘todo Múnich’ seguía hablando incluso seis meses después.

Mysliveček fue  un mentor importante para Mozart en ese momento, introduciéndolo a las últimas tendencias en la composición de la ópera seria italiana. Mitridate  de Mozart se puede describir sin exagerar como una obra de "Mysliveček", con Mozart tomando prestadas una serie de ideas musicales de la ópera  La Nitteti de Mysliveček para su propia ópera. Mysliveček proporcionó a su joven amigo Wolfgang Amadeus Mozart importantes modelos compositivos en los géneros de la sinfonía, la ópera seria italiana y el concierto para violín; tanto Wolfgang como su padre Leopold Mozart lo consideraron un amigo íntimo desde el momento de sus primeros encuentros. Estuvo cerca de la familia Mozart hasta 1778, cuando los contactos se rompieron después de que no cumpliera su promesa de organizar una comisión de ópera para Mozart en el Teatro San Carlo de Nápoles. Anteriormente, los Mozart encontraron irresistible su personalidad dinámica. En una carta a su padre Leopold escrita desde Munich el 11 de octubre de 1777, Mozart describió su carácter como "lleno de fuego, espíritu y vida". A menudo se han observado similitudes en su estilo musical con las obras anteriores de Mozart. Además, Mozart usó motivos musicales extraídos de varias composiciones de Mysliveček para ayudar a crear arias de ópera, movimientos sinfónicos, sonatas para teclado y conciertos. También hizo un arreglo del aria de Mysliveček "Il caro mio bene" (de la ópera "Armida" de 1780). El texto antiguo fue reemplazado por el nuevo texto "Ridente la calma", KV 152 (210a), en una partitura para soprano con acompañamiento de piano.

Edición discográfica de "Sinfonías" de Josef Mysliveček

Según la misma carta de Wolfgang Mozart escrita desde Munich el 11 de octubre de 1777, un cirujano incompetente quemó la nariz de Mysliveček mientras intentaba tratar una enfermedad misteriosa. Una carta de Leopold Mozart a su hijo del 1 de octubre de 1777 se refiere a la enfermedad como algo vergonzoso por lo que Mysliveček merecía el ostracismo social. La reputación de promiscuidad sexual de Mysliveček, las insinuaciones de Leopold y la referencia a la desfiguración facial en la carta de Wolfgang insinúan inequívocamente los síntomas de la sífilis terciaria. La explicación de Mysliveček sobre su condición a Wolfgang: cáncer de huesos causado por un accidente de carruaje, parece absurdo. La preocupación que Mozart le reveló a su padre en ese momento por los sufrimientos de Mysliveček fue muy conmovedora. En toda la correspondencia de Mozart, ningún individuo fuera de la familia Mozart fue nunca la causa de tanta efusión de emociones como la que se encuentra en la referida carta de Mozart.

Después de su llegada a Italia en 1763, Mysliveček nunca abandonó el país excepto por una visita a Praga en 1767-1768, una breve visita a Viena en 1773 y una estadía prolongada en Munich entre diciembre de 1776 y abril de 1778. Su regreso a Praga llevó a la producción de varias de sus óperas. Fue invitado a Munich por el establecimiento musical del elector Maximiliano III José para componer una ópera para la temporada de carnaval de 1777 (“Ezio”). Casi todas sus óperas tuvieron éxito hasta una desastrosa producción de “Armida” que tuvo lugar en el Teatro alla Scala de Milán.para la temporada de carnaval de 1780. Uno de los muchos honores que recibió por su talento como compositor de ópera fue el encargo de proporcionar la música para la apertura de un nuevo teatro de ópera en Pavía en 1773 (su primera puesta en escena del libreto de Metastasio “Demetrio”). Aparte de la reputación de promiscuidad registrada en la correspondencia de Mozart, no se sabe nada de la vida amorosa de Mysliveček. El compositor nunca se casó y no se registran nombres de amantes. No hay documentación que respalde informes de enlaces románticos con las cantantes Caterina Gabrielli y Lucrezia Aguiari.
Mysliveček y Wolfgang Mozart se encontraron por última vez en Múnich , momento en el que Mysliveček ya estaba gravemente enfermo. Mozart lo visitó en el hospital y escribió sobre el encuentro en una carta a su padre con mucho detalle y gran emoción.

En los últimos años de su vida, Mysliveček sufrió  importantes problemas de salud y dolores causados ​​por una enfermedad progresiva , probablemente sífilis. A pesar de esto, sin embargo, continuó componiendo óperas y piezas instrumentales. Tres años antes de su muerte, presentó una de sus mejores óperas, “L'Olimpiade”, que se representó en honor al onomástico del Rey de España. Un comentario de la época dice: La famosa aria "Se cerca, si dice", en particular la segunda parte "Che abisso di pene, lasciare il suo bene" , fue recibida con asombro, rozando el frenesí.  La música que Mysliveček escribió para esta aria es verdaderamente una obra maestra del estilo vocal más bello y elocuente y utiliza un acompañamiento completamente nuevo y muy complejo. Además de la enfermedad, Mysliveček también tenía problemas financieros  y tuvo que recurrir a varios préstamos de un banco para los pobres. Financieramente irresponsable durante toda su vida, murió en la indigencia en Roma a los 43 años de edad. Está enterrado en la iglesia de San Lorenzo in Lucina , donde se puede ver un monumento colocado por los admiradores checos de los últimos días. Nunca se ha encontrado ningún rastro de un monumento en mármol supuestamente erigido poco después de su muerte por James Hugh Smith Barry, un rico estudiante inglés de Mysliveček que pagó los gastos de su funeral. Fue un compositor checo que contribuyó a la formación del clasicismo musical de finales del siglo XVIII.

Busto de Josef Mysliveček en el frontis de su casa de Praga

Josef Mysliveček se convirtió en una de las principales personalidades musicales de toda Europa. Fue en su tiempo el compositor de ópera más solicitado de Italia  y puede describirse sin exagerar como el artista de origen checo más célebre del siglo XVIII. Logró la maestría en casi todos los principales géneros musicales de la época. Se destacó entre sus contemporáneos de las décadas de 1760 y 1770 al escribir algunas de las mejores óperas serias de la época, así como conciertos, sinfonías y piezas de cámara de gran éxito. Podríamos describir el estilo musical de Mysliveček como firmemente arraigado en el gusto italiano de la época, pero con muchos elementos centroeuropeos que adquirió mientras estudiaba en Praga. Mysliveček compuso sus óperas basándose en los libretos favoritos de la época. Uno de los autores más populares asociados con la ópera seria fue el poeta Pietro Metastasio , quien escribió dieciséis de los libretos de las veintiséis óperas de Mysliveček. Las tramas de estas óperas tienen lugar en regiones distantes o en la antigüedad y presentan, por ejemplo, emperadores y comandantes romanos o gobernantes antiguos como sus héroes. Las tramas de ópera también se inspiraron con frecuencia en los mitos griegos clásicos. Además de la ópera, Mysliveček también escribió exitosos oratorios, dramas musicales religiosos sobre temas bíblicos.

Mysliveček compuso ocho oratorios en siete años, pero hasta el día de hoy solo se conservan las partituras de cuatro de ellos:  "Tobia", "Adamo ed Eva", "La passione di Gesù Cristo" e "Isacco, figura del redentore". El oratorio mencionado en último lugar es uno de los aspectos más destacados de la obra de Mysliveček, y en el pasado se lo denominó erróneamente como la pieza de Wolfgang Mozart. El género más prestigioso en el campo de la música instrumental en las décadas de 1760 y 1770 fue la sinfonía . Mysliveček fue uno de los principales escritores sinfónicos de su época y sin duda el mejor de sus contemporáneos en Italia. Sus composiciones instrumentales incluyen además, por ejemplo, destacados conciertos de violín, cuartetos y quintetos de cuerda, quintetos de oboe y octetos para instrumentos de viento. Muchas de las arias operísticas de Mysliveček circularon en iglesias y monasterios checos, donde fueron copiadas con textos religiosos latinos, pero sus óperas no se representaron en absoluto durante el siglo XIX y las primeras décadas del siglo XX. Las composiciones de Mysliveček evocan un estilo elegante y diatónico típico del clasicismo italiano en la música. Sus mejores obras se caracterizan por la inventiva melódica, la continuidad lógica y cierta intensidad emocional que puede atribuirse a su personalidad dinámica.